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醇脱氢酶催化乙醇氧化为视黄醛的测定方法与核心注意事项
醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase, ADH）在视觉循环中扮演着至关重要的角色，它负责催化视黄醇（维生素A醇）氧化生成视黄醛。这一过程是视觉色素再生的关键步骤。无论是进行生物化学研究、药物开发还是营养学评估，准确测定醇脱氢酶的活性都具有重要意义。本文将详细介绍基于分光光度法的测定原理、具体步骤，并深入剖析实验中的关键注意事项，以确保结果的准确性和可靠性。
一、测定方法：分光光度法
目前最常用且便捷的方法是紫外分光光度法。其核心原理是：氧化反应中辅酶NAD⁺被还原为NADH，而NADH在340 nm波长处具有特征性吸收峰，而NAD⁺在此波长下无吸收。通过监测340 nm处吸光度（Abs）随时间的变化速率，即可计算出酶活性。
1. 实验原理：
醇脱氢酶（ADH）催化以下反应：
视黄醇 + NAD⁺ ⇌ 视黄醛 + NADH + H⁺
通过检测NADH的生成速率来反映ADH的酶活性。
2. 试剂准备：
- 缓冲液： 通常使用50100 mM磷酸盐缓冲液（PBS）或TrisHCl缓冲液（pH 7.27.6），以维持稳定的反应环境。
- 底物： 视黄醇（需先用无水乙醇或脱氧胆酸盐助溶，因其疏水性强）。临用前配制，避免氧化。
- 辅酶： βNAD⁺（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸），用缓冲液新鲜配制。
- 酶源： 待测样本（如组织匀浆上清液、细胞提取液或纯化的酶液），需预冷并在冰上操作。
- 终止液： 必要时可使用强酸（如5%三氯乙酸）终止反应。
3. 操作步骤（以96孔板或比色皿为例）：
- 空白对照设置： 在比色皿中加入缓冲液、NAD⁺溶液和乙醇（用于溶解视黄醇的溶剂），混匀。此步骤用于校正底物和辅酶自身的本底吸收。
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反应体系构建：
- 向比色皿中加入预定体积的缓冲液。
- 依次加入适量NAD⁺溶液和视黄醇乙醇溶液。
- 将比色皿放入预温至37°C的分光光度计中，恒温孵育12分钟。
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启动反应与测定：
- 加入一定体积的酶液，迅速混匀。
- 立即开始计时，并连续监测340 nm波长下吸光度值的变化至少35分钟，记录时间吸光度曲线。
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计算酶活性：
- 选择线性变化最好的时段，计算每分钟吸光度的变化值（ΔAbs/min）。
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酶活性（U/mL） = (ΔAbs/min × V_t × DF) / (ε × d × V_e)
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ΔAbs/min：每分钟吸光度的变化值 -
V_t：反应体系总体积（mL） -
DF：样本稀释倍数 -
ε：NADH在340 nm下的摩尔消光系数（6.22 × 10³ L·mol⁻¹·cm⁻¹） -
d：比色皿光径（cm，通常为1 cm） -
V_e：加入的酶液体积（mL）
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- 酶活性单位（U）通常定义为：在测定条件下，每分钟催化生成1 μmol NADH所需的酶量。
二、核心注意事项与常见问题解析